轮状病毒与肠上皮细胞相互作用机制的研究进展 轮状病毒（rotavius , Rv ）是世界范围内婴幼儿腹泻病的最主要病原。alashar 等对1986-2000年全世界出版的相关文献资料进行统计发现，每年由Rv 腹泻所致的儿童住院病例数为200 万，其中死亡病例数为35.2-59.2 万。Rv 是呼肠弧病毒科中的一个属，其基因组为含有11 个片段的双链RNA ，分别编码病毒蛋白vP1-4 、vP6 、VP7和病毒非结构蛋白NSP1-6 ，其中VP4 在蛋白酶作用下可裂解为VP5和VP8两个亚单位。RV 腹泻的防治及疫苗研制均有赖于对其致病机制的阐明。近年来随着分子生物学、免疫学的迅速发展，对RV致病机制的研究逐渐深人。 1 RV 对肠上皮细胞的作用 1.1 Rv 的黏附和进人      RV主要感染近端小肠成熟的上皮细胞。过去认为，病毒与其受体的相互作用均依赖于唾液酸（SA）的存在；然而近年来很多研究发现，对于14 种人类Rv 来说，均为SA 非依赖的。另有研究表明，猪Rv 受体主要为糖脂类；而牛和人类Rv 受体主要为糖蛋白类，其中N-连接型糖蛋白在Rv 感染中发挥的作用较O-连接型更为重要。目前普遍认为，与受体作用的主要配体为病毒蛋白VP4 ，它是病毒感染细胞的吸附蛋白，与病毒的毒力直接相关；同时也是与RV 抗原性有关的主要结构蛋白，能刺激机体产生病毒中和抗体，但对蛋白酶敏感。 关于RV 的黏附，近年来发现有多种细胞表面分子是Rv 结合的受体，如整合素和热休克蛋白。如有研究表明，整合素α2β1亚基可以与vP4 的DEG序列结合；也有研究发现，细胞表面晚期抗原VLA-2 、VLA-4参与了病毒粘附细胞的过程，并指出RV外壳蛋白VP4含有结合这些抗原的序列，使用针对这些抗原的抗体后，可以阻断大约30 ％的病毒感染；另有研究提出，Rv 粘附细胞的过程是多步骤并且顺序发生的：RV 蛋白VP8先与SA 相互作用，使得        VP4构象发生微妙变化，进而VP5可以与整合素α2β1作用，紧接着VP5与HSC70作用，VP7与αvβ3αxβ2作用。而后三种作用是否为顺序发生或仅为选择性发生，目前尚不清楚：然而，同时也有研究指出，在K-562 细胞，VLA-2和VLA-4 的转染和表达能够增加病毒的结合常侵入，但在MA-104 、HT-29 和Caco-2 细胞却并非如此：困比，这些抗原成分可能并不是主要的Rv 受体．但是它们对于病毒侵人细胞并产生有效感染发挥了作用。 Rv 进入细抱是通过受体介导的Ca依赖的细胞内吞作用：当感染性RV 开始内吞进人细胞时，导致了Ca从内吞小泡流向胞质，一旦内吞小泡中Ca浓度低于稳定病毒外壳蛋白所需要的Ca浓度时，外壳蛋日降解，病毒随着内吞小泡膜的溶解而进人胞质，然而经胰岛素处理过的病毒能直接穿透细胞膜，说明VP4裂解后不仅增强了病毒的感染性，而且增加了病毒的穿透力。在这个过程中，VP4 裂解后蛋白之一的VP5发挥了主要作用，它能够单独与细胞表面受体发生相互作用，从而介导病毒侵人宿主细胞。通过对VP4、VP5、和VP8透化单层大泡的能力进行实验研究发现，只有VP5 能够透化LUVs。同时发现，LUVs 的透化能够被VP5特异性单克隆中和抗体所阻断，却不能被VP8特异性单克隆中和抗体阻断。 1.2 RV的复制和释放Rv   进人肠上皮细胞后，在感染细胞的胞质内，借助依赖RNA的RNA聚合酶（VP1-3 ）和Rv 非结构蛋白NSP1-4 的作用进行复制。单层壳病毒颗粒通过从粗面内质网（RER ）出芽后组装为成熟的病毒颗粒，形成双层壳病毒粒子，外面包绕来自RER 的外膜。 过去认为Rv 释放是通过细胞溶解释放，存在于宿主细胞中。然而，通过运用激光共聚焦扫描显微镜和小泡运输抑制剂，对极化的肠上皮Caco-2 细胞进行研究时发现，RV 尽乎仅从Caco-2 细胞的顶端释放；电镜观察也证实，Rv 被包含在平滑小泡内，位于细胞顶部区域，并且在刷状缘细胞外可以见到自由的病毒粒子，这说明RV 是经由囊泡运输系统从肠上皮极化细胞顶端释放的，而不是通过细胞溶解释放的。 l.3 RV 致腹泻的机制  关于RV引起腹泻的机制，传统观点认为RV感染破坏了小肠粘膜上皮细胞，从而引发水、电解质分泌和渗透性腹泻以及吸收失调性腹泻。也有观点认为，RV 腹泻是由于肠绒毛局部缺血导致的粘膜上皮破坏所致。近几年来，细胞紧密连接结构和功熊的破坏、宿主细胞蛋白质运输受干扰以及NSP4 的肠毒素作用在Rv 致腹泻中的作用受到广泛关注。 1.3.1 细胞间紧密连接破坏肠上皮细胞间连接对于建立和维持细胞的极化状态，发挥其正常生理功能至关重要。对caco-2 细胞的实验研究面显示，Rv 感染引起紧密连接（TJ）相关蛋白，如TJ 咬合蛋白的分解或其分布的改变，但不伴有细胞完整性的破坏；然而，中间连结相关蛋白，如上皮细胞E-钙黏蛋白却无明显改变。由于中间连结位于TJ 下方，说明RV 感染后细胞屏障的开放定位于细胞连接区域的上部，即TJ 区域。另有文献报道，细胞骨架的改变也可以引起TJ 的破坏；同时TJ 可能还发挥了受体的作用。 1.3.2 细胞蛋白质运输受干扰  肠上皮刷状缘膜上双糖酶的存在对于维持肠腔渗透压的稳定有重要作用。有研究显示，RV感染阻断了蔗糖酶-异麦芽糖酶（SI ）从高尔基体向刷状缘膜的运输，但不影响SI 生物合成及其成熟和稳定，亦不伴有明显的细胞破坏，推测其原因是由于病毒感染干扰了微绒毛细胞骨架的组建，从而使蛋白质的定位受到影响。微绒毛细胞骨架的破坏可能与NSP1和NSP2的作用有关，也可能是病毒感染通过生化反应间接改变了细胞骨架的构建，如胞浆Ca浓度的升高可以导致微绒毛分解和改变。 1.3 .3 NSP4 的肠毒素样作用  1996 年Ball等发现新生小鼠腹腔接种NSP4后可导致年龄和剂量依赖性腹泻，首次提出RV 非结构蛋白NSP4 可能是一种肠毒素，在Rv 致腹泻中发挥了重要作用。Mirazimi等的研究表明，NSP4 是内质网特异性跨膜糖蛋白，其N 端定位于内质网腔内，而C 端则延伸至感染细胞的胞浆内，可作为胞浆内RV内层颗粒的细胞内受体，在病毒形态发生过程中发挥辅助作用。Ball等的研究同时发现，NSP4 肽段114-135具有肠毒素活性，其致病效应与病毒无异。Boshulzen 等采用酵母双杂交技术，对来源于Caco -2 细胞的cDNA 文库进行筛选，发现层粘连蛋白β3和纤维连接蛋白-1 能够与NSP4 结合；缺失分析显示，NSP4 氨基酸残基序列87-145 是与受体结合的区域。目前认为NSP4 引发腹泻的可能机制如下：( l ) NSP4 与受体结合激活了磷脂酶C-三磷酸肌醇级联反应，动员细胞内Ca库释放Ca，使细胞内Ca浓度升高，导致cl分泌增加；( 2 ) NsP4 使细胞膜的通透性增加，同时改变了上皮细胞的完整性，影响物质吸收；( 3 ) NsP4阻止上皮细胞间TJ 相关蛋白ZO-1的锚定，从而影响TJ和极化上皮的形成， NSP4 还可以进一步改变细胞内肌动蛋白的分布来发挥致病作用；( 4 ) Halahel等发现，NsP4肽段114-135 对兔小肠刷状缘膜上的Na-右旋葡萄精同向转运有抑制作用，从而导致水、钠重吸收障碍。然而，也有研究提出不同看法，认为在实验小鼠，NSP4 与病毒毒力无相关性。综上所述，对于NSP4 与Rv 致腹泻之间的关系还有待进一步研究确定。 2 肠上皮细胞对RV 感染的应答 Rv 腹泻的发病机制不仅包含病毒对宿主细胞的作用，同时肠上皮细胞对病毒感染的应答也参与了致病过程。宿主细胞的应答反应，一方面可以看作是肠上皮细胞抵御粘膜感染的一种自我保护机制，另一方面促进了疾病的发生。与其他肠道病原感染相似，肠上皮细胞受RV 感染后，上皮细胞发生空泡化甚至缺失，绒毛闭塞，上皮隐窝增生；与此同时，Rv 同样能引起肠粘膜的炎症反应，导致细胞因子的释放和炎症细胞的聚集。然而，与其他肠道病原相比，由RV 引起的肠粘膜炎症反应较轻。近年来研究表明，肠神经系统( enteric  nervous system , ENS ）的激活以及某些生物活性物质的释放是肠道应答Rv 感染的重要环节。 2．1 ENs 被激活    Lundgren等的研究显示，钠离子通道阻滞剂河豚毒素、局部麻醉剂利多卡因以及胆碱能受体阻滞剂六甲双铵、美加明均能够减轻RV 所致的实验鼠腹泻，表明ENS 参与了病毒导致的水、电解质分泌过程。通过进一步对实验相关数据的分析得知，约有67 ％的肠液分泌效应是由于刺激了ENS 引起的，这也解释了为何相对较少的顶端绒毛上皮细胞的感染也能够引起大量肠上皮隐窝细胞水、电解质的分泌。相关研究也证实，在儿童应用消旋卡多曲、脑啡肽酶抑制剂可以成功治疗RV引起的分泌性腹泻。推测激活ENS 的机制如下：( l ) NSP4 的肠毒素作用引起细胞内Ca浓度升高，触发肠道内分泌细胞释放胺和／或肤类物质，刺激了位于肠上皮层下的神经树突或自由神经末梢，引起分泌性的神经反射；(2）小肠炎症反应及炎症介质的释放刺激了肠感觉传入神经，引起分泌效应；(3）VP7可能通过一种非经典的内质网-高尔基体运输机制到达神经元轴突，使初级神经元被病毒感染，从而刺激了ENS。 2 .2 肠道生物活性分子的释放  当细菌或病毒感染肠道时，上皮细胞或免疫细胞释放大量的生物活性分子。No 在No 合酶的作用下形成，而许多肠道病原体能够诱导NO 合酶的生成。有研究显示，No 能通过增加细胞内cGMP 的水平而促进肠上皮细胞分泌。前列腺素是花生四烯酸环氧合酶途径下的产物，前列腺素E2在前列腺素H 合成酶的催化下，也能够刺激肠上皮细胞分泌Cl。NO或前列腺素E2可能是通过与神经元上的相应受体结合，导致树突膜去极化引发动作电位，从而引起分泌效应。 综上所述，对Rv 致病机制的研究近年来取得了较大进展，但仍然存在很多尚未阐明的环节。深人探讨Rv 与宿主细胞相互作用的机制，有助于抗Rv 药物的研究及RV疫苗的研制，对RV感染腹泻防治将起到很大的促进作用。