Toll样受体参与慢性HBV感染免疫应答的研究进展

作者：徐春利 吴珺 郑昕 杨东亮

全球大约有3.5亿慢性HBV感染者，慢性HBV感染可致肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。HBV慢性感染的结局取决于病毒与机体的免疫应答，包括天然和获得性免疫应答之间的相互作用。天然免疫在HBV持续感染中的作用日益受到重视。近来大量的研究表明Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)在启动天然免疫应答中具有重要作用，本文对TLRs在HBV慢性持续感染中的影响予以综述。

天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线，模式识别受体(patten recogniton receptors，PRRs)如TLRs在识别微生物成分中发挥着重要作用。TLRs不仅能够识别外来病原及内生坏死物质，而且也能快速发挥抗病毒作用。

目前发现的TLRs家族中共有13个成员即TLR1-13，人类表达TLR1-10，TLRs表达在不同的组织及细胞，包括天然免疫及获得性免疫的效应细胞（特异性T淋巴细胞及B淋巴细胞）等，因此TLRs在天然及获得性免疫反应中都发挥作用。根据亚细胞定位，TLRs分为两类，即表达在细胞膜上的TLR1/2/4/5/6/11/12及表达在细胞内体的TLR3/7/8/9。一旦TLRs识别病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular pattens, PAMPs)，效应细胞通过招募的接头蛋白如髓样分化初始反应蛋白88 (myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)、Toll/IL-1受体区包含的街头蛋白(Toll/IL-l receptordomain containing adaptor protein，TIRAP)、TIR结构域诱导干扰素β(IFNβ)产生的接头蛋白(TIR domain containing adaptor protein inducing interferon β,TRIF)及TRIF相关的接头分子启动下游信号传导同。除了TLR3募集TRIF外，其他的TLRs通过MyD88发挥作用。TLR4目前为止是唯一既可以活化MyD88又可以活化TRIF的TLR。虽然MyD88及TRIF下游信号通路不同，但MyD88及TRIF下游信号通路可以通过活化蛋白激酶如白细胞介素1(IL-1)受体相关激酶(interleukin-l receptor associated kinases, IRAKs)。

核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、干扰素调节因子(interferon-regulatory factor，IRFs)及其他转录因子如肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptorassociated factors, TRAFs)，表达各种促炎因子如TNFα、IL-1、IL-6及共刺激分子如CD80、CD86及I型IFN等发挥作用，因此活化TLRs有助于协调炎症反应及抗病毒作用同。

1．TLRs在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中的表达：外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)在外周的免疫防御及抵抗外来病原感染上发挥着重要作用。目前的研究显示，TLRs介导的天然免疫应答在清除HBV感染中具有重要作用，但TLRs在慢性乙型肝炎(CHB)患者PBMC中的表达状况尚存争议。Chen等对CHB和健康自愿者PBMC中TLR1-10 mRNA水平进行了分析，发现TLR1/2/4/6的表达水平明显低于健康对照者，进一步的流式分析显示TLR2在CHB患者中显著降低，用TLR2和TLR4的配体刺激PBMC后可阻碍细胞因子IL-6、IL-8、TNFα的产生。

Momeni等通过实时定量PCR方法检测CHB与健康者PBMC中TLRs信号分子的表达，发现CHB中IRAK4、TRAF3及IRF7表达明显低于健康者，认为TLRs信号分子的表达降低，破坏了机体对HBV的免疫应答。Wang等对处于活动期的CHB及肝衰竭患者PBMC中TLRl-10 mRNA水平分析的结果显示，TLR3/5/7/9/10在活动期的CHB患者中的表达上调，而TLR2/4/6 mRNA在肝衰竭患者中的表达上调。TLR9mRNA表达水平与ALT、总胆红素(TBil)呈负相关，与HBVDNA病毒载量呈正相关，提示HBV可能通过抑制TLR9表达而损伤肝细胞。Xu等发现活动期的CHB患者浆样树突细胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)及PBMC上TLR7 mRNA、蛋白表达及TLR9mRNA表达低于健康志愿者，而TLR9蛋白表达高于健康者，其TLR7蛋白表达与HBV DNA呈负相关，TLR9蛋白表达与HBV DNA呈正相关，表明HBV抑制TLR7及TLR9 mRNA的表达，导致机体对HBV的免疫逃逸及免疫耐受。

此外，Vincent等发现，CHB携带者TLR9mRNA及TLR9蛋白表达低于及健康志愿者，用TLR9激动剂(CpG 2216)及HBV刺激CHB患者和健康自愿者的PBMC和pDCs后，结果显示HBV损伤pDCs及PBMC上TLR9的转录活性、减少TI。R9 mRNA及蛋白的表达，进而抑制TLR9介导pDC及PBMC分泌IFNα，参与HBV的持续感染，而对同样位于pDC的TLR7没有影响。Li等发现，CHB患者单核细胞来源的树突状细胞(monocyte-derived DCs，MoDCs)表达TLR3及IFNβ明显减少，表明HBV感染通过下调TLR3/IFNβ信号通路改变机体的天然免疫应答，导致HBV持续感染。Hui等发现在恢复期CHB患者中，TLR7的表达增加，上调TLR7可能与CHB患者HBsAg的清除有关。

Visvanathan等对TLR2和TLR4表达与HBeAg的关系进行了探讨。他们对HBeAg阳性或阴性的CHB患者肝穿刺肝组织中肝细胞和枯否细胞及PBMC上TLR2和TLR4表达进行了分析，结果显示HBeAg阳性CHB患者中TLR2在肝细胞、枯否细胞及PBMC上的表达显著低于HBeAg阴性CHB及健康者，但TLR4的表达在各组中无区别。进一步体外研究表明，HBeAg的存在降低了TNFα的产生和磷酸化的P38激酶的表达，而HBeAg的缺失上调了TLR2信号通路，TNFα仅表达增加。综上所述，TLRs在CHB患者PBMC中的表达状况差异很大，这可能与研究者选取的CHB患者的病情活动度、HBeAg、HBVDNA载量、基因型、宿主的遗传背景及患者的免疫状况等有关。

2．TLRs介导天然免疫应答抑制HBV复制：TLRs能介导肝实质及非实质细胞（如枯否细胞及肝窦内皮细胞等）调节HBV感染的天然及获得性免疫应答。吴珺等发现用TLR1/3/4/6/7/9刺激小鼠肝细胞后能抑制HBV-Met细胞中HBV的复制。 Chisari研究团队用TLR2/3/4/5/7/9的特异性配体注射HBV转基因小鼠，发现除TLR2以外的配体都抑制肝内HBV的复制。而TLR2/4/9配体刺激转染了HBV质粒的HepG2细胞产生IFN及炎性因子抑制HBV复制。Wu等报道，TLR经特异性配体活化，可促进枯否细胞及肝窦内皮细胞产生细胞因子(TNFα、IL-6)，抑制HBV-met细胞中HBV的复制；而刺激TLR3和TLR4能诱导IFNβ及其他效应因子的表达抑制HBV复制。

HBV感染中激活TLRs能调节天然免疫应答及获得性免疫应答，而另一方面，HBV也可能影响TLRs介导的免疫应答。最近，对于Huh7及HEK293细胞的研究表明，HBeAg与TLR2下游信号共定位，扰乱TLR的相互作用，干扰TLR介导的下游炎症转录因子、NF-κB及IFN β的活化，抑制抗病毒作用。转染HBV多聚酶的肝细胞系(PH5CH8，HepG2)的研究发现，HBV多聚酶干预TLR3信号通路中的TBK/IKKe从而抑制IFNβ产生损伤其抗病毒作用。

Kumar等来自HBV转基因小鼠研究表明，乙型肝炎病毒X蛋白不能干预TLR3激动剂polyα(I：C)诱导IFN β的产生，而是与接头蛋白干扰素启动刺激因子-1即另一条模式识别受体维甲酸诱导基因-1样受体信号通路中的接头蛋白结合，抑制IFNβ的活化。此外，Wu等的实验结果也显示用HBV-Met细胞上清液，HBsAg，HBeAg和HBV病毒颗粒预处理实质和非实质性肝细胞（枯否细胞、肝窦内皮细胞），降低TLR下游的信号转导分子如IRF-3，NF-κB，ERK1/2和IFNβ的表达抑制TLR抗病毒效应。这些研究结果表明HBV C基因、X基因及多聚酶基因可能影响TLR信号通路干预机体清除HBV。这些位点的突变有可能干扰天然免疫应答，进而影响疾病的严重性、机体对病毒的免疫逃避及对核苷类似物的耐药。

3．TLR激动剂在慢性HBV感染中的治疗前景：CHB患者主要采用IFN或核苷类似物治疗。IFN的低应答率及核苷类似物的耐药是目前治疗CHB面临的主要问题。最近有研究报道刺激天然免疫应答可以增强机体的抗病毒能力并具有长期的抗病毒效果。

Lanford等利用慢性HBV感染的黑猩猩作为研究模型，发现短期口服小分子的TLR7的激动剂GS-962（每周3次，1 mg/kg治疗4周，停1周后，以2 mg/kg的剂量再治疗4周），可以诱导IFNα产生，激活干扰素刺激因子及NK细胞和淋巴细胞亚群，从而激活黑猩猩免疫细胞中的TLR7信号而达到降低血清和肝脏中的HBV DNA水平，减少肝脏中HBV抗原阳性的细胞。此外，TLR7的激动剂GS-962作为一种抗HBV和HCV的佐剂已经在美国用于前期临床研究。

来自香港的研究报道TLR9的激动剂与传统的乙型肝炎疫苗相结合能够提高抗-HBs产生速度及延长抗体持续时间。并且，TLR9激动剂(1018 ISS)作为疫苗佐剂已用于I临床试验中。毫无疑问，采用TLRs激动剂激活HBV感染天然免疫应答及获得性免疫应答，有望成为控制HBV复制的新的治疗手段。

TLRs在HBV持续感染中的作用越来越受到人们关注。尽管TLRs在CHB患者PBMC中的表达状况尚存争议，但在小鼠体内体外的实验及肝细胞系上的研究结果表明TLRs介导的天然免疫应答在清除HBV感染中具有重要作用。更重要的是，TLR激动剂有可能通过刺激天然及获得性免疫应答而增强机体的抗病毒能力，从而成为新的HBV感染的治疗手段。

来源：中华肝脏病杂志