胃癌细胞和胃癌多药耐药细胞中P-gp及GST的表达

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，对人的健康和生命造成了极大的威胁，胃癌在两性间、不同年龄、不同国家或地区的发病均有很大的差异。胃癌的治疗以手术和化疗为主，因为许多患者就诊时胃癌已处于F中晚期，失去了手术治疗的时机，所以化疗成了这一时期的主要治疗方法。但目前的化疗效果差，已严重影响患者生存率，造成这一结果主要原因是胃癌的多药耐药(MDR)。P-糖蛋白(P-gp)和药物代谢的功能酶GST认为与MDR相关。故本研究旨在探讨胃癌细胞和胃癌多药耐药细胞中P-gp和GDT的表达差异。
1. 材料与方法
1.1主要试剂 多柔比星（阿霉素ADR）购自浙江海正；DMEM培养液Sigma Inc；兔抗人P-gp单克隆抗体，兔抗人GST单克隆抗体、山羊抗兔即用型SP试剂盒及浓缩型DAB试剂盒均购自北京博奥森生物。
1.2细胞培养及相关试剂的配制
1.2. 1 人胃癌细胞培养：人胃癌SGC -7901细胞由西安交通大学医学院第一附属医院消化内科实验室提供，人胃癌SGC-7901/ADR细胞由第四军医大学消化内科实验室惠赠。①细胞的复苏：在超净工作台内将冻存管迅速由液氮罐转入到37℃水浴中，轻轻振荡快速解冻。当人胃癌SGC-7901和SGC-7901/ADR细胞完全解冻后。常规离心、加培养液、消化和计数，37℃，5% C02培养箱中密闭培养。②细胞传代：仔细观察显微镜下细胞的生长情况，当出现细胞轮廓不清、折光性强、胞质内无空泡、脂滴、颗粒性物质、细胞生长密度在70% -80%时，进行常规细胞传代。③细胞培养：将SGC-7901、SGC-7901/ADR细胞用含有ED-TA的0.25 %胰蛋白酶消化后，血细胞计数盘计数。用含10%胎牛血清、100 μ/mL、100 mg/mL青、链霉素双抗液的DMEM培养液将SGC -7901、SGC-7901/ADR细胞制备为5 x104个/mL细胞悬液，吹打均匀后接种于96孔细胞培养板内，每孔100μL，SGC -7901/ADR细胞培养液中需另加阿霉素，工作液浓度为0.5μg/ml，使细胞维持耐药性。37℃，5% C02培养箱培养。
1.2. 2 阿霉素的配制：将10 mg阿霉素用50 mL生理盐水溶解后，滤器过滤除茵，配成0.25 mg/mL储备液分装置于- 20℃冰箱备用。配制过程均要在超净工作台内进行，并严格无菌操作。
1. 3 免疫细胞化学染色
1.3.1 细胞爬片的制备：在超净工作台内，将处理好的盖玻片放人24孔板中。待SGC-7901、SGC-7901/ADR细胞生长密度至70% - 80%后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，接种在预先放置盖玻片的24孔板上，每孔1 mL细胞悬液，每组设6个复孔，置于5% C02，37℃培养箱中培养。培养48 h后，弃去旧的培养液，PBS冲洗细胞，5 min x 3次。在每个作用孔内加入4%多聚甲醛固定10 min，后用PBS冲洗，5 min x 3次。取出细胞爬片，用中性树胶将其固定于洁净的载玻片上，细胞面朝上放人切片盒中，- 20℃保存备用。
1.3. 2 免疫细胞化学染色：将细胞爬片置于室温下复温，PBS浸泡。置于湿盒槽上，滴加0.1%Triton 5min，弃去Triton，用PBS冲洗，5 min x3次。滴加3%H202，室温孵育15 min，弃去H202液，用PBS冲洗，5min x 3次。滴加试剂A液，室温孵育15 min，倾去。分别滴加1：500稀释的P-gp抗体，1：300稀释的GST抗体，空白对照组用PBS代替一抗，放入湿盒中，4℃孵育，过夜。取出湿盒，在室温下复温20 min，用PBS冲洗，5 min x3次。滴加试剂B液（生物素标记山羊抗兔IgG），室温孵育10 min，弃去B液，后用PBS冲5 min x3次。滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下控制显色3 -5 min，自来水充分冲洗约10 min。苏木素复染2～3 min，自来水冲洗l min。用1%盐酸酒精分化，自来水冲洗1 min，用PBS冲洗，5 min x3次。依次梯度酒精脱水，每次5 min，后用二甲苯透明，10 minx2次。爬片干燥后，中性树胶封固，置于37℃烤箱中过夜。光学显微镜下观察或常温避光保存。
1. 3.3 结果判定：观察每张切片，P-gp、GST可表达于细胞质和细胞膜，阳性细胞染色呈棕褐色或棕黄色，随机选择15个具有代表意义的高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，取平均数作为结果，无陌性细胞记为0分，阳性细胞数< 25%记为1分，阳性细胞数25 % - 50%记为2分，阳性细胞数50% -75%记为3分，阳性细胞数> 75 %记为4分。染色强度以多数呈现的染色特征为标准：元染色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。将两种得分相加，0-1分为阴性(-)，2 -3分为弱阳性(+)，4 -5分为中度阳性（++），6-7分为强阳性(+++)；（+）视为低表达，(++)、(+++)视为高表达。
1.3. 4 灰度的测定：片子处理及DAB染色前的各步方法与SP染色法相同，DAB染色后，自来水充分冲洗约10 min。依次用60%、70%、80%、90 %、100%、100%梯度酒精脱水，每次5 min，后用二甲苯透明，10mln x 2次。爬片干燥后，中性树胶封固，置于37℃烤箱中过夜。细胞爬片在光镜下采用统一放大倍数(10 x 20)，每张切片随机摄取10个视野进行观察和分析，输入计算机作为测定试场。通过图像分析仪测定每个视野灰度值，取其平均值为该片染色强度。
1. 4 统计学方法 所有实验数据均用x±s表示，经SPSS 16.0统计软件进行处理，p<0. 05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌SGC-7901、SGC-7901/ADR细胞培养情况
胃癌SGC-7901、SGC-7901/ADR细胞接种于96孔培养板，培养24 h后细胞贴壁，在光学显微镜下观察，各孑L内细胞紧贴板壁，细胞之间接触紧密，细胞质透亮，细胞核圆形，可见分裂期细胞象。SGC-7901细胞外形呈短棒梭形、多边形，SGC-7901/ADR细胞外形呈长梭形（见图1）。
2.2 免疫细胞化学检测两种细胞中P-gp及GST蛋白表达及灰度测定 免疫细胞化学SP法染色后，P-gp蛋白阳性者在胃癌细胞的胞浆和胞膜中可见棕黄色颗沉着，GST在胃癌细胞的胞浆中可见棕黄色颗粒（见图2、3）。P-gp、GST在胃癌SGC -7901细胞中呈中度表达，在胃癌SGC -7901/ADR细胞中呈高表达，两者比较有显著性差异（p<0.05）。免疫细胞化学灰度定量测定显示同样的结果（见表1）。

3 讨论
目前大多数研究认为胃癌的多药耐药( MDR)是化疗缓解率低的主要原因。多种因素参与了肿瘤的多药耐药，目前研究的主要有：①P170糖蛋白（P-gp）高表达；②多药耐药相关蛋白( MRP)；③肺耐药相关蛋白( LRP)高表达；④酶类系统改变；⑤DNA损伤修复能力改变；⑥抑制凋亡，凋亡途径异常；⑦肿瘤细胞特定生化特征的改变；⑧信号转导通路异常改变；⑨细胞外环境改变；⑩其他相关因素等。
P-gp和GST的高表达是目前研究较多的多药耐药机制。大量的研究证明胃癌组织和细胞中P-gp和GST呈阳性表达，罗明惠等用免疫组织化学SP法检测79例胃癌组织中P-糖蛋白（P-gp）、DNA拓扑异构酶Ⅱ( TopoⅡ)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST-π)的表达，结果发现P-gp、GST-π表达增加。杜静平等以脉冲式诱导方法建立了胃癌耐阿霉素细胞SGC-7901/ADR和胃癌耐顺铂细胞SGC-7901/DDP，并用Western blot检测到耐药细胞中P-gp和MRP的表达比敏感细胞明显增加。GST是药物代谢的功能酶，可加速药物的降解，降低药物的细胞毒性。在许多人体恶性肿瘤中有高表达并与肿瘤的化疗药物耐受性相关，能促使细胞毒性药物代谢成无毒性物质而排出细胞外，从而降低抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用，增加细胞的耐药性。P-gp属于转运蛋白超家族，是依赖ATP的膜转运蛋白，P-gp与药物结合，同时在其核苷酸结合位点上结合ATP，其作用抑制与“泵”相似，可称为“药物泵”，ATP水解后所释放的能量使药物转出细胞外，导致药物浓度下降，其细胞毒作用减弱或完全丧失，同时可通过主动转运将细胞内的毒性药物移到胞外，细胞由此产生耐药性。
综上所述，胃癌细胞和胃癌多药耐药中P-gp和GST的差异表达是胃癌化疗失败的原因之一，今后应进一步研究其分子机制。来源：华语消化网