多重连接依赖性探针扩增方法在脊髓性肌肉萎缩症基因诊断中的应用

作者：丁宇,余永国,叶晓来,王莹　　作者单位：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 (上海 200127)

　　摘要： 目的 探讨多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 方法在脊髓性肌肉萎缩症 (SMA) 基因诊断中的应用，指导SMA的遗传咨询。 方法 收集3 例疑似SMA的患儿及其父母的外周血标本，提取基因组DNA，应用MLPA技术进行分析。 结果3 例患儿均存在运动神经元存活基因端粒侧 (SMN1) 的纯合缺失，拷贝数为0;患儿父母均存在SMN1基因的杂合缺失，拷贝数为1。结论 MLPA技术可以应用于SMA患儿的基因诊断，不仅快速、简便，还可辨别携带者致病基因杂合缺失情况，可筛查携带者。

　　关键词： 多重连接依赖性探针扩增; 脊髓性肌肉萎缩症; 运动神经元存活基因

　　Application of multiplex ligation-dependent probe amplification in molecular diagnosis of spinal muscular atrophy

　　DING Yu, YU Yong-guo, YE Xiao-lai, WANG Ying (Shanghai Children’s Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong UniversitySchool of Medicine, Shanghai 200127, China)

　　Abstract: Objectives To study the application of multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) in molecular diagnosis of spinal muscular atrophy (SMA) as basis for SMA genetic counseling. Methods Peripheral blood samples were collected from three SMA suspected patients and their parents. Genomic DNA was isolated and analyzed by MLPA. Results MLPA analysis showed that all the 3 children had homozygous deletion of the survival of motor neuron l (SMN1) gene and the copy number was 0. Both of the parents had heterozygous deletion of the SMN1 gene and the copy number was 1. Conclusions Application of MLPA in molecular diagnosis of SMA not only makes diagnosis quick and easy, but also identifies and screens the gene heterozygous deletion of carriers.

　　Key words: multiplex ligation-dependent probe amplification; spinal muscular atrophy; survival motor neuron gene

　　脊髓性肌肉萎缩症 (spinal muscular atrophy，SMA)，简称脊肌萎缩症，是一种以脊髓前角运动神经元退行性病变为病理特征的常染色体隐性遗传病，发病率约为1/10 000，在不同的人群中携带者的发生率为1/40至1/60[1,2]。该病的致病基因为运动神经元存活基因(SMN )，定位于 5 号染色体长臂 1 区 3 带 (5ql3)，全长为20 kb，含 8 个外显子，在 1 条染色体上有 2 种拷贝，在端粒侧称SMN1，着丝粒侧称SMN2 。两者间有 5 个碱基对的差别。研究表明，约95%SMA患者存在着SMN1 基因第 7 号外显子的纯合性缺失[3]。2002年，由Schouten等[4]建立起来的多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 技术是一项新的基因拷贝数定量方法，不仅可以检测SMN1的纯合性缺失，而且可以检测该基因的杂合性缺失，因而可以区分SMA携带者和正常人。本研究利用MLPA技术，对2011年在我院 3 例疑似SMA患儿进行确诊，并对其父母的SMN基因拷贝数进行了同步测定。现将结果报告如下。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　3 例患儿为 2011 年在我院就诊的疑似SMA的病例。例 1 为 3 个月的男性婴儿，G1P1，足月剖腹产 (因胎动减少)，否认产时窒息、抢救史，出生体质量 3 550 g，因呼吸道感染就诊，体检发现其四肢肌力 I~II 级、肌张力降低，肌电图检查提示神经源性损害累及四肢肌。例 2 为 7 个月的女婴，G2P1 (第 1 胎为孕 3 个月时人工流产)，足月顺产，孕期胎动减少，否认产时窒息、抢救史，出生体质量 3 350 g，家长觉患儿四肢活动少而就诊，体检发现患儿四肢肌力II级、肌张力降低，肌电图检查提示神经源性损害累及四肢肌。例 3 为 6 个月的女婴，G1P1，孕36周顺产，否认产时窒息、抢救史，出生体质量2 900 g，生后 100 d 时因不能抬头至当地医院行头颅CT检查，提示脑发育迟缓，此次因肺部感染收治入院，临床表现为矛盾呼吸，四肢肌力 I~II 级、肌张力降低，血清肌酸磷酸激酶 (CPK) 正常。该 3 例患儿父母均为非近亲婚配，表型正常。父母接受过我院的遗传咨询，并签署知情同意书。

　　1.2 方法

　　1.2.1 外周血DNA提取 采集患儿及其父母的外周血2~3 ml，置含EDTA抗凝剂的采血管中，应用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒抽提DNA。

　　1.2.2 MLPA法 试剂盒 (SALSA MLPA Kit P060-B2)购自荷兰MRC-Holland公司，根据说明书进行变性、杂交、连接和PCR反应。PCR产物均在3100-Avant遗传分析仪 (ABI公司) 上进行毛细管电泳，Genesean软件自动计算得到每个产物峰的绝对峰面积 (APA)。将所得APA数据导入Excel表格中，得到每个样本中每对探针靶序列峰的相对峰面积 (RPA)，再将RPA除以 5 个标准参考对照样本 (均具有 2 个SMN1基因拷贝和 2 个RPA，RPA=此产物峰APA/同一样本中所有参考探针的靶序列产物峰APA之和SMN2 基因拷贝) 中相对应的产物峰RPA的中位值，即得到比值，也就是该序列的相对拷贝数，最后将比值乘以校正系数即得到相应探针靶序列的绝对拷贝数。分析的靶序列为SMNl 和SMN2基因的第 7、8 外显子，其在标准参考对照中的拷贝数均为 2，因此校正系数均为 2。相对拷贝数在 0.45 与 0.70 之间的基因绝对拷贝数属于 1 拷贝范围，在 0.70 与 1.30 之间则属于 2 拷贝范围，在 1.30 与 1.55 之间的属于3拷贝范围。

　　2 结果

　　2.1 MLPA图谱

　　根据MLPA图谱，可以直观地看到 3 例患儿及其父母的SMN1基因与SMN2 基因信号峰值的变化。

　　例 1 家系成员中，患儿纯合缺失SMN1基因的 7 号和 8 号外显子的产物峰;与正常人的MLPA图谱比较，患儿双亲SMN1 基因的 7 号和 8 号外显子的产物峰低于正常峰值，即SMA携带者部分缺失SMN1 基因的第7、8 号外显子。见图 1。例 2 家系成员中，患儿纯合缺失SMN1 基因的 7 号和 8 号外显子的产物峰，患儿双亲SMN1 基因的 7 号和 8 号外显子的产物峰出现杂合缺失，同时患儿与其母亲皆存在SMN2 基因的 7 号和 8 号外显子产物峰的增高。见图 2 。例 3 家系成员中，患儿也纯合缺失SMN1 基因的 7 号和 8 号外显子的产物峰，患儿双亲SMN1基因的 7 号和 8 号外显子的产物峰也出现杂合缺失，并且患儿父亲出现了SMN2 基因的 7 号和 8号外显子产物峰的杂合缺失。见图3。

　　2.2 MLPA结果

　　综合分析患儿MLPA结果显示，3 例患儿SMN1 基因的 7 号和 8 号外显子的拷贝数皆为0，为纯合缺失，例1、3患儿的SMN2 基因拷贝数正常，例 2 患儿的SMN2基因拷贝数属于 3 拷贝范围。

　　分析患儿父母MLPA结果显示，3例患儿父母SMN1基因的7号和8号外显子的拷贝数皆属于1拷贝范围，存在杂合缺失，且例3患儿父亲的SMN2 基因为杂合缺失，拷贝数属于1拷贝范围，而第2例患儿母亲的SMN2 基因拷贝数属于3拷贝范围。见表 1。

　　3 讨论

　　脊肌萎缩症是一组常见的常染色体隐性遗传病，其特征为脊髓前角运动神经元 (部分为脑干运动神经核)退行性变而引起的肌肉萎缩与瘫痪[5]。临床主要表现为下运动神经元进行性对称性肌无力和肌萎缩，近端重于远端，下肢重于上肢。根据SMA发病年龄和病程不同将其分为 3 型：I 型脊肌萎缩症又称Werdnig-Hoffmann病，患儿于出生后 6 个月内发病，表现为严重的全身肌无力和肌张力降低，不能独坐或走，多于2岁内死于呼吸肌麻痹;II型也称为中间型SMA，出生后6~18 个月间发病，患儿可独坐，但不能独立站立和行走，大多能存活 2 年以上;III型又称Kugelberg-Welander病、轻型SMA，1 岁半后发病，多数仅表现有肌力弱，可以保持独立行走和站立的能力，一般在成年后死亡。SMA患者CK正常或轻度增高，通常小于正常值上限的5 倍。肌电图呈神经源性损害，有纤颤波、正锐波等自发电位，运动电位波幅增高，时程延长，传导速度正常。肌肉活检为神经源性肌萎缩改变。本组 3 例患儿临床表现均符合 I 型脊肌萎缩症，但由于家长各方面的顾虑都未进行肌肉活检。

　　近年来，随着分子生物学的发展，在SMA相关基因的研究方面取得了重大的进展。Lefebvre等[3]通过物理作图和连锁分析，在5号染色体长臂1区3带发现约20 kb的基因与SMA密切相关，称之为运动神经元存活基因 (SMN )。研究表明，约95%的SMA患者存在着SMN1 基因第 7 号外显子的纯合性缺失。对SMN1 基因的分析有助于确诊SMA患者及SMN 基因突变携带者，Prior等[6]建议，夫妇在怀孕或孕早期作SMN1 基因的分析，以避免产下SMA患儿。

　　目前对SMN1基因拷贝数进行检测的方法有：聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP) 分析[7]、变性高效液相色谱法 (DHPLC)[8]、实时定量聚合酶链反应 (real-time PCR)[9]，但PCR-RFLP法无法检测SMN1 基因的杂合性缺失，因而无法区分SMN 基因突变携带者和正常人，DHPLC方法只能检测杂合突变，Real-time PCR方法操作复杂，重复性差，因而这些方法都难以在临床诊断SMA及SMN基因突变携带者中广泛应用。2002年荷兰的Schouten等[4]设计发明了MLPA技术，该技术是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术，仅需少量的DNA，即可通过变性、杂交、连接、PCR扩增及毛细管电泳步骤，在同一反应管中对几十个不同的靶基因进行检测和定量分析。与以往的检测技术相比，该技术可对待检测基因的所有外显子进行缺失、重复等异常改变进行全面检测。国内外已有学者报道将该技术应用于SMA的基因检测[10,11]。

　　本研究将MLPA技术引入了SMA的基因诊断中，对 3 例临床表现疑似脊肌萎缩症的患儿进行了确诊，通过MLPA方法，发现该 3 例患儿为SMN1 基因的纯和缺失。并且通过MLPA方法检测其父母的基因发现，患儿父母均存在SMN1 基因的杂合缺失，这对其以后的生育具有指导意义。虽然肌肉活检是确诊脊肌萎缩症的金标准，但是操作比较复杂，创伤性较大，许多家长都会有所顾虑，而且无法明确父母是否是致病基因的携带者。因此，将MLPA技术应用于SMA疾病的基因诊断，不仅可以简便、快速检测该致病基因的所有外显子的缺失、重复突变，而且还可进行半定量分析，可辨别携带者致病基因杂合缺失情况，对携带者进行筛查，解决了SMA携带者的鉴定问题，对SMA的遗传咨询具有重要意义。

　　参考文献：

　　[1] Smith M，Calabro V，Chong B，et al . Population screening and cascade testing for carriers of SMA [J]. Eur J Hum Genet，2007，15(7)：759-766.

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　　[3] Lefebvre S，Burglen L，Reboullet S，et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene [J]. Cell，1995，80(1)：155-165.

　　[4] Schouten JP，McElgunn CJ，Waaijer R，et a1. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification [J]. Nucleic Acids Res，2002，30(12)：e57.

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　　[10] Scarciolla O，Stuppia L，De Angelis MV，et al. Spinalmuscular atrophy genotyping by gene dosage using multiple ligation-dependent probe amplification [J]. Neurogenetics，2006，7(4)：269-276.

　　[11] 古艳，谢建生，韩春锡，等. 应用多重连接依赖探针扩增技术对脊髓性肌萎缩患者及致病基因携带者进行基因诊断[J]. 中华临床医师杂志，2010，4(3)：1512-1519.来源：创新医学网